Rt-qPCR反應條件的控制

日期:2024-07-08 02:18
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摘要: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 PCR反應條件的控制: 1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 2. 鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。 3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。 4. TaqDNA聚合酶2.5U(100...

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。




PCR反應條件的控制:



1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。


2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。

3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。

4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。

5.  引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。

6.  反應溫度


(1)變性溫度和時(shí)間95℃,30 s。


(2)退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。


(3)延伸溫度和時(shí)間72℃,1 min/kb(10 kb內)。


(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)



7.  循環(huán)次數 :一般為25 ~30次。循環(huán)數決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數為30個(gè)左右,循環(huán)數超過(guò)30個(gè)以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期"。